先天性巨结肠症和肛门直肠畸形甲基化CpG结合蛋白2基因

第3外显子突变分析

伍美   高红   弭杰   黄英   张志波   王维林  

先天性巨结肠症(Hirschsprung disease, HSCR)和肛门直肠畸形(anorectal malformations, ARM)是小儿常见的消化道畸形^[1-2]｡遗传流行病学研究提示,HSCR和ARM为多基因遗传的复杂疾病,但其遗传方式､外显率等均不清楚,易感基因尚未确定^[3-4]｡甲基化CpG结合蛋白2(methyl CpG-binding protein-2, MeCP2)基因在新生儿脑病､智力低下及许多先天性畸形疾病中被发现^[5-8]｡MeCP2基因已成为联系基因型与人类神经发育性疾病的重要转录抑制因子,本研究采用病例对照研究设计,利用DNA直接测序的方法对HSCR和ARM患儿进行MeCP2基因第3外显子(MeCP2?鄄E3)基因筛查,分析其变化与HSCR和ARM的关系,为探讨影响HSCR和ARM的遗传因素提供依据｡

资料与方法

一、研究对象

研究样本均来自2001年1月至2010年6月中国医科大学附属盛京医院小儿外科｡HSCR组120例,其中男92例,女28例,平均年龄4.1岁,经钡灌肠､直肠黏膜乙酰胆碱酯酶组织化学检查､直肠肛管侧压和术后病理切片证实均为散发性HSCR｡ARM组50例,男37例,女13例,平均年龄3.1岁,经手术确诊,均符合ARM诊断标准｡对照组为无血缘关系的健康儿童120名,其中男81名,女39名,平均年龄3.6岁,经询问病史及体格检查,排除先天性畸形｡所有研究对象均签署知情同意书｡

二､实验方法

1. 基因组DNA的提取：抽取研究对象静脉血（EDTA抗凝），每份样品均取200 µl，用苯酚-氯仿法提取全基因组DNA。经紫外分光光度仪测定DNA吸光度值（A）₂₆₀／A₂₈₀比值在1.7～1.9 之间为合格标本。

2. PCR：引物由上海英骏生物技术有限公司（Invitrogen Biotechnology Co., Ltd）合成。MeCP2-E3引物(409 bp)，上游:5"-GGG CCT CAA GGA CAA ACC-3",下游: 5"-ACC CTG GGC ACA TAC ATT-3"。PCR反应体系:50 μL 反应体系中包括:10 ×Buffer 5μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，Primer(12.5 pmol/μl ) 0.5 μl, 0.5U 高保真Taq DNA 酶。PCR 反应程序为: 94℃ 3 min, 94℃ 40 s ,55℃ 40 s,72℃ 40 s,30个循环,72℃ 10 min。PCR 产物于2 %的琼脂糖凝胶电泳。

3. PCR产物的测序验证：选取正常对照120名、HSCR 120例和ARM 50例，将PCR产物纯化后进行DNA自动测序仪测序(北京华大生物工程公司)。用Chromas软件将测序结果与美国NCBI基因库所公布的AF030876序列进行对比（BLAST）。对存在基因突变的序列反向测序加以证实。

三、统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，病例组与对照组之间率的比较采用Fisher确切概率法。

结  果

一、目的基因片断的扩增及检测结果

利用上述特异引物对研究HSCR组和ARM组MeCP2-E3进行PCR扩增，得到特异性PCR产物，见图1。

二、HSCR组测序结果

    对每个PCR产物均做了MeCP2-E3序列测定,测序结果显示,120例HSCR患儿中,有45例(37.5%)存在MeCP2-E3的突变,其中7例(5.8%)第296位碱基置换突变 C→T(引发氨基酸的改变),是突变型纯合子,见图2A;5例(4.2%)第417 位碱基置换突变 G→C(引发氨基酸的改变),也是突变型纯合子,见图2B;33例(27.5%)在这两个位点发生了相同突变(但没有氨基酸的改变),为突变型杂合子,见图2｡正常对照组未见突变发生｡HSCR组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)｡

三、ARM组测序结果

讨  论

遗传流行病学研究表明,HSCR和ARM是由多个基因与数种环境因素共同作用产生的复杂疾病^[9]｡人类MeCP2基因位于染色体Xq28区,属于X染色体失活区｡基因全长约76 kb,含有4个外显子｡MeCP2基因所编码的MeCP2蛋白属于DNA结合蛋白大家族中一员,是一种转录抑制因子,能选择性地与甲基化的CpG(甲基胞嘧啶)结合,特别是含单个甲基化的CpG｡MeCP2在人类发育一定阶段抑制其脑内调控基因的转录, MeCP2基因突变导致蛋白结构和功能异常,使胚胎发育时期应当转录静止的基因继续转录,而这种“转录噪音”对神经系统的生长和发育具有致病作用^[10]｡MeCP2基因的突变包括点突变､缺失､插入等,其中常见的突变是CpG热点突变(均为C→T转换,约占突变的70%),1个是C-末端的20~100 bp的热点缺失(约占总突变的9%)｡这些突变导致MeCP2蛋白截断､不稳定或异常折叠而失去正常功能｡

目前,测序被认为是检测己知或未知序列变异的“金标准”^[11]｡我们应用基因测序的方法首次报道了与HSCR和ARM患儿的MeCP2-E3突变情况,结果显示HSCR和ARM在MeCP2-E3处存在点突变,而在正常儿童中未发现MeCP2-E3突变｡MeCP2是胚胎正常发育不可缺少的因子^[12]｡在已证实的MeCP2基因为致病基因的Rett综合征(Rett syndrome, RTT)患者中,MeCP2-E1的突变率不足1%,MeCP2-E2突变率更低^[13]｡因此,本实验主要研究MeCP2基因在胚胎发育异常的HSCR和ARM疾病中突变率较高的E3突变情况｡但是本研究的ARM病例组研究对象仅为50例,不除外由于样本量较少而导致MeCP2-E3的突变率较正常儿童高,所以其临床意义尚需加大样本进一步研究｡

另外,本研究仅对MeCP2-E3编码区进行基因测序,因此,推断除该基因的编码区可能存在突变情况外,也可能存在其它的方式影响基因的转录或转录后修饰,进而影响MeCP2基因的表达,如非编码区异常｡非编码区虽不能编码蛋白质但对于遗传信息的表达是不可缺少的,在它上面有调控遗传信息表达的核苷酸序列,是具有遗传效应的,基因非编码区也可能发生突变,如碱基的插入､缺失和替代｡非编码区的3′端非翻译区(3′ UTR)和启动子区均有存在异常的可能,如长约8.5 kb的3′UTR,在3′ UTR有多个区域高度保守,提示这些区域可能对于维持MeCP2基因的功能具有重要的意义｡因此,进一步对非编码区进行研究可能会寻找到HSCR和ARM的发生机制｡

参 考 文 献 略